DE2509783A1 - Decapeptidamide - Google Patents

Decapeptidamide

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DE2509783A1 DE19752509783 DE2509783A DE2509783A1 DE 2509783 A1 DE2509783 A1 DE 2509783A1 DE 19752509783 DE19752509783 DE 19752509783 DE 2509783 A DE2509783 A DE 2509783A DE 2509783 A1 DE2509783 A1 DE 2509783A1
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    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/13—Luteinizing hormone-releasing hormone; related peptides

Description

5KOLNUDEICHMANNHAUs Köln, den 5.3.75
AvK/IM
Takeda Chemical Industries, Ltd., 27, Doshomachi 2-chome, ' Higashi-ku, Osaka /Japan
Decapeptidamide
Die Erfindung betrifft neue Decapeptidamidderivate mit starker ovulationsinduzierender Wirkung der Formel
(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2
worin R1 Tyr oder Phe, R2 D-NIe, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr oder D-Met und R^ Leu, He oder Nie bedeuten·
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Decapeptidamidderivate der Formel (l).
In der Beschreibung und den Patentansprüchen sind Aminosäuren und Peptide und ihre aktivierten Carboxyl- oder Schutzgruppen mit Abkürzungen bezeichnet, wie sie entv/eder auf dem betreffenden Fachgebiet gebräuchlich sind oder vom Committeeon Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB vorgeschlagen wurden· Wenn nicht anders angeführt ist, weisen die Aminosäuren L-Konfiguration auf.
Folgende Abkürzungen wurden beispielsweise verwendet: Abui a-Aminobuttersäure .
Arg: Arginin
BOC: tert-Butoxycarbonyl .
BzI: Benzyl
DCC: N^'-Dicyclohexylcarbodiimid
GIy: Glycin ;
His: Histidin ". "
HQNB: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid He: Isoleucin
Leu: Leucin
Nie: Norleucin 509837/0963
Nva: Norvalin
Met: Methionin
CMe: Methylester * '
OBzI: Benzylester ·
ONB: N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester OSu: N-Hydroxysuccinimidester Phe: Phenylalanin Pro: Prolin (Pyr)Glu: Pyroglutaminsäure Ser: Serin Thr: Threonin Tos: Tosyl
Trp: Tryptophan .
Tyr: Tyrosin
Es ist seit Jahren bekannt, daß der Hypothalamus Faktoren enthält, welche auf höherer Ebene die Sekretion tropischer Hormone aus der Hypophyse regeln.
Nach der Isolation eines Thyrotropin freisetzenden Hormons (TRH), wurde ein Hormon, das lutein-isierende Hormone freisetzt (LH-RH), in reiner Form aus Schweinen und Schafen extrahiert und als ein Decapeptid der folgenden Struktur identifiziert: (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH«· (Ä.V. Schally et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 43, 1334 (1971): R.Guillemin et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S.A., 69, 278 (1972)]. Auf diese Erkenntnis folgte die Herstellung einer Anzahl ähnlicher Peptide, mit den analogen Peptiden wurden auch biologische Tests durchgeführt. Da jedoch die physiologische Wirksamkeit des Peptids selbst durch geringfügige Modifikationen in der oben angeführten Aminosäurezusannnensetzung stark beeinträchtigt wird, muß die oben angeführte chemische Struktur als wesentlich für die Erzielung der maximalen physiologischen Wirksamkeit angesehen werden.
(A.V.Schally et al, Biochem· Biophys. Res. Commun«», 4, 366 (19728*
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-a. ■ ■
Kürzlich veröffentlichten Monahan et al in "Biochemistry11, Band 12, Nr. 23, Seiten 4616-4620 (1973), daß unter den von ihnen hergestellten LH-RH-Ana logen wie z.B. /"AIa J7LH-RH, /"D-AIa6J7LH-RH, /"VaI6J7LH-RH, /^-Val^LG-RH, /"Pr0 6J7LH-RH und /TD-PrO6J7LH-RH jene der Formel /"D-AIa6J7LH-RH die stärkste Wirksamkeit aufweist, nämlich 350 - 450 % der Wirksamkeit der Stamm-LH-RH-Verbindung. Die Literatur lehrt wei- ters, daß LH-RH-Analoge, die in Stellung 6 eine D-Aminosäure mit einer größeren Anzahl von .Seitenketten aufweisen, als D-AIa, weniger wirksam sind als das Stammhormon. Trotz des . oben angeführten Standes der Technik ist es gelungen, Polypeptide der Formel (i), in welchen die D-Aminosäure in Stellung 6 eine größere Anzahl von Seitenketten aufweist als D-AIa1 herzustellen~und auf ihre LH-RH-Wirksamkeit zu testen. Dabei wurde überraschend gefunden, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide der Formel (i) um wenigstens 1000 % wirkungsvoller.' sind als ihre Stamm-LH-RH-Hormone. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Erkenntnissen.
Hauptziel der Erfindung ist daher die Bereitstellung von neuen Decapeptidamidderivaten der Formel (i) und starker ovulationsinduzierender vjirksamkeit.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Decapeptidamidderivate der Formel (i). "V-
Das Decapeptidamidderivat der Formel (i) wird nach einem Verfahren hergestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß
ein Reaktant (A) L-Pyroglutaminsäure oder ein Peptid-
fragment, das eine N-endständige L-Pyroglutaminsäureeinheit (d.h. (Pyr)-Glu) und gleichzeitig von dort an die oben angeführte Aminosäuresequenz aufweist —-mit einem Reaktanten (B) einer Aminkomponente, welche dem Rest des Decapeptidamid-
derivates der Formel (i) entspricht kondensiert wird, wo-
- 3 - ■■"·.. 509837/0963
bei die beiden Reaktanten gegebenenfalls durch eine oder mehrere Schutzgruppen geschützt sind, welche dann entfernt werden·
Der Reaktant (A) ist daher !.-Pyroglutaminsäure oder ein Peptidfragment, das eine N-endständige L-Pyroglutaminsäure aufweist und gleichzeitig von dort an die Aminosäuresequenz der Formel (i) besitzt. Der mit dem Reaktanten (A) zu kondensierende Reaktant (B) ist eine Aminkomponente, welche dem Rest des Decapeptidamidderivates der Formel (i) entspricht, wobei die Reaktanten (A) und (B) gegebenenfalls geschützt sind»
Grundlegende Kombinationsmöglichkeiten der Reaktanten (A) und (B) sind aus der nachstehenden Tabelle 1 ersichtlich.
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Tabelle 1
NReaktant
Kombina-\
tion \		 (A) (B)
1 (Pyr)Glti-OH H-His-Trp-Ser-Rj^ -R2-
R5-ArS-PrO-GIy-KH2
2 (Pyr)Glu-His-OH H-TrP-SeT-R1-R2-R5-
Arg-Pro-Gly-NH2
3 (Pyr)Glu-His-
Trp-OH		 H-SeT-R1-R2-R5-ATg-
PrO-GIy-Mi2 ' ',
' "4 . (Pyr)Glu-His-
Trp-Ser-OH		 H-R1-R2-R5-ATg-PrO-
GIy-M2 ■,:--'■■·
5 (Pyr)Glu-His-
Trp-Ser-R^OH		 H-R2-R5-ATg-PrO- .
GIy-M2 - "" ·'"
6 . (Pyr) Glu-His-.
Trp-S Bi^-R1-B2-OH		 H^-Arg-Pro-Gly- : - -.
.HH2 " -·■ - .';-; '
7 •
(Pyr)Glu-His-
Trp-Ser-R^P^-
R5-OH .		 H-Arg-Pro-Gly-M2
8 (Pyr)Glu-His-Trp-
SSr-R1-R^-R5-ATg-
OH		 H-Pro-Gly-i3H2 . . ■
(Pyr)Glu-His-Trp-
Ser-R-L-Rg^-Arg-
Pro-OH		 H-GIy-IiH2 ...'·-':'
10 (Pyr)Glu-His-Trp-
Ser-R^-R^R-^-Arg-
Pro-Gly-OH '		 NH5 . · ν:-v
- 5 -509837/0963
L /NSPECTED
Es ist auch bekannt, daß eine geschützte L-Glutamylgruppe.der allgemeinen Formel (ll)
RXO-CH0CH0CH(NH0)Co- , (II)
worin F^eine Alkoxygruppe wie z.B. Methoxy, Äthoxy, n-Propoxy, iso-Propoxy, n-Butoxy od.dgl., eine Aralkyloxygruppe v/ie z.B. Benzyloxy od.dgl., oder Amin bedeutet, leicht in die L-Pyroglutamylgruppe der Formel ·
durch in Kontaktbringen mit einer Base wie ζ»8- Ammoniak u.dgl· oder einer Säure wie z.B. Essigsäure od.dgl. umgewandelt werden kann und daß die Gruppe der Formel (ll) in .dieser Hinsicht der L-Pyroglutamylgruppe selbst äquivalent ist· Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf der Annahme aufgebaut, daß das L~Pyroglutamyl (d.li: (Pyr)Glu-) des Reaktanten (A) nicht nur die L-Pyroglutamylgruppe selbst, sondern auch die geschützte L-Glutamylgruppe der Formel (ll) einschließt» Wenn das (Pyr)Glu™ des Reaktanten (A) die Gruppe (ll) darstellt, kann die Gruppe (ll) leicht nach an sich bekannten Verfahren in die L-Pyroglutamylgruppe selbst umgewandelt werden« ■
Die erfindungsgemäße Kondensationsreaktion kann nach für die Herstellung von Peptidbindungen bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispiele für solche Kondensationsverfahren sind da s DCC/HONB-Verfahren (BE-PS 796.399}, da s Azidverfahren, das Chloridverfahren, das Saureanhydridverfahren, das gemischte Saureanhydridverfahren, das DCC-Ver-
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■ . ORIGINAL INSPECTED ' - · \
l.
fahren, das Aktivesterverfahren, das. des Woodward-Reagens K-Verfahrens, das Carbodiimidazolverfahren, das Oxidationsreduktionsverfahren und andere /"vgl. The Peptides Band 1 (1966), Schröder und Lubke, Academic Press, New York, USAJ7·
Vor der Kondensation können die Carboxyl- und Aminogruppen, welche an der beabsichtigten Reaktion nicht teilnehmen sollen, geschützt werden oder die an der Reaktion teilnehmenden Carboxyl- und/oder Aminogruppen nach an sich bekannten Verfahren aktiviert werden. Die Carboxylgruppen in den Ausgangsstoffen können in Form von Metallsalzen (z.B. Natrium- und Kaliumsalzen) oder von Estern (wie .ζ·Β. Methyl, Äthyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, tert-Butyl- oder tert.-Amylestern) geschützt werden.
Als Schutzgruppen für die Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien sind alle bei der Herstellung der Peptide gebräuchlichen Schutzgruppen für Aminogruppen, wie ζ·Β. die Benzyloxycarbonyl-, tert-Butoxycarbonyl-, Isobornyloxycarbonylgruppen geeignet. Die Iminogruppe des Histidins kann durch jede herkömmliche Schutzgruppe wie z.B. die Benzyl-, Tosyl-, 2,4-Dinitrophenol-, tert-Butoxycarbonyl- oder Carbobenzoxygruppe geschützt werden. Die Hydroxylgruppe des Serins kann durch jede herkömmliche Schutzgruppe wie z.B. die Benzyl-, tert.-Butylgruppe und andere ätherbildende Gruppen geschützt werden· Die Hydroxylgruppe des Tyrosins kann mit der Benzyl-,, tert.-Butyl- und anderen ätherbildenden Gruppen, die Guanidinogruppe des Arginins mit Gruppen wie z.B. die Nitro-, Tosyl-, Carbobenzoxy-, Isobornyloxycarbonyl- oder Adamantyloxycarbonylgruppe geschützt werden. Als Beispiele für aktivierte Carboxylgruppen in den Ausgangsmaterialien seien das entsprechende Säureanhydrid, Azid oder aktive Ester ^fd.h. Ester mit Alkoholen wie z.B. Pentachlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,4-Dinitrophenol, Cyanomethylalkohol, p-Nitrophenol, N-Hydroxy-
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5-norbornen-2,3-dicarboximid, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxybenztriazol_7, genannt. Die aktivierten Aminogruppen in den Ausgangsmaterialien können z.B. das entsprechende Phosphorsäureamid sein.
Aus der nachstehenden Tabelle sind Beispiele für Korn- . binationen solcher Formen von Carboxyl- und Aminogruppen in den Produkten (A) und (B) ersichtlich.
Tabelle 2
Beispiele für
Kombina tionen		 Ausqanqsmaterialien COOH NH2 IB) · COOH NH2
I+ (A) frei geschützt geschützt frei
2 aktiviert geschützt frei frei
3 frei geschützt geschützt aktiviert
Anmerkung: In dem mit bezeichneten Fall liegt im Reaktionssystem vorzugsweise ein Dehydratisierungsmittel wie z.B. ein Carbodiimid wie Dicyclohexylcarbodiimid vor· Eine Ausführungsform der Erfindung ist im nachstehenden Reaktionsschema dargestellt.
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. —J-
NO0
(Pyr)GIu-His-Trp + SeT-R1-Schutzgruppe
Kondensation (z.B.DCC/HONB) Z-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2
(PyrjGlu-His-Trp-Ser-Rj-Schutzgruppe ι Entfernung einer Schutzgruppe
Entfernung einer Schutz- I (z'B· in Gegenwart von HBr)
gruppe (z.B. katalytische
Reduktion mit Pd Katalysator)
(PyT)GIu-HiS-TrP-SeT-R1 R2"R2
(Pyr JGIu-HiS-
(Pyr Kondensation (z.B. in Gegenwart von DCC/HONB oder DCC/1-Hydroxybenztriazol)
NO2
Entfernung einer Schutzgruppe (z.B. in Gegenwart von SnCl2 in Ameisensäure-Wasser, katalyti-. scher Reduktion mit einem Pd Katalysator oder
-R1-R2-R3-ATg-PrO-GIy-NH2
Diese Reaktion kann in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Das Lösungsmittel kann das gleiche sein wie es bei Peptidkondensationsreaktionen verwendet wird, ζ·Β. können wasserfreies oder wässeriges Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Pyridin, Chloroform, Dioxan, Di chlorine than, Tetrahydrofuran sowie geeignete Mischungen solcher Lösungsmittel als Beispiele angeführt werden.
Die Reaktionstemperatur liegt innerhalb eines Bereichs, welcher als für Reaktionen zur Peptidbindungsbildung geeignet bekannt ist, d.h. gewöhnlich innerhalb eines Bereichs von etwa-20 bis etwa 300C. Die PreCursorprodukte (die geschützten Peptide) der herzustellenden erfindungsgema'ßen Verbindungen können leicht nach dem Festphasesyntheseverfahren hergestellt werden.
Nach Beendigung der Kondensationsreaktion können die gegebenenfalls vorhandenen Schutzgruppen nach bekannten Verfahren entfernt werden. Als Beispiele hiefür seien katalytische Reduktion in Gegenwart eines Katalysators wie Palladiumschwarz, Palladium auf Kohle, Platin od.dgl., Solvolyse mittels Fluorwasserstoff, Trifluoressigsäure od.dgl., und Reduktion mit metallischem Natrium in flüssigem Ammoniak genannt.
Das so hergestellte Peptid der Formel (i) kann aus dem Reaktionsgemisch nach an sich für die Gewinnung von Peptiden bekannten Verfahren wie z.B. Extraktion, Verteilung, Säulen-Chromatographie u.dgl. gewonnen werden·
Die erfindungsgemäße Reaktion kann nach jedem an sich bekannten herkömmlichen Festphaseverfahren durchgeführt werden·
Das Peptid der Formel (i) kann auch/in Form eines Salzes oder einer Metall-Komplexverbindung gewonnen werden.
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Als Säuren, die mit den Peptiden der Formel (l) Salze bilden, seien anorganische Säuren wie Salzsäure, Bromwasserstoff säure, Perchlorsäure, Salpetersäure, Rhodanwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure u.dgl. und organische Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Ahthranylsäure, Zimtsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanylsäure genannt.
Beispiele für Metalle, die mit den Peptiden der Formel (i) Metall-Komplexverbindungen bilden können, sind wie oben Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen. Derartige Metall-Komplexverbindungen können nach herkömmlichen Verfahren wie z.B. Umsetzen des Peptides der .Formel (i) mit dem Hydroxid oder Oxid eines der vorstehend angeführten Metalle bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide der Formel (l) besitzen LH-RH-Wirkung (d.h., sie setzen ein luteinisierendes Hormon frei) und fördern daher die Sekretion von luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH). Die Polypeptide der Formel (i) sind daher für die Verwendung zur Förderung der Ovulation bei Frauen und Tieren wie z.B. Ratten, Schafen, Schweinen, Kühen, Stuten, Wachteln oder Hühnern geeignet, sie können auch für andere pharmazeutische Zwecke, fur welche bisher herkömmliche LH-RH, LH und FSH-Präparate einge- ,. setzt worden sind, verwendet werden.
Da die LH-RH-Wirkung der Polypeptide der Formel (l) etwa 10 bis 25 mal stärker ist als die LH-RH-Wirkung der in der Natur vorkommenden Verbindungen, kann ihre Dosierungsmenge für jede Anwendung auf der Basis dieses Vielfachen ermittelt werden, wobei auch andere Faktoren (wie z.B. der Empfänger der
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Verabreichung oder die Art der Krankheit) in Betracht zu ziehen sind. So kann z.B. eine geeignete Dosierungsmenge innerhalb eines Bereiches von etwa 5 ng (Nanogramm) bis 10 ug täglich pro Kilogramm Körpergewicht liegen.
Polypeptide der Formel (i) werden vorwiegend nicht-•peroral, d.h. mittels Injektion, rektal oder vaginal verabreicht, obgleich sie in manchen Fällen auch peroral verabreicht werden.
Als Beispiele für geeignete Darreichungsformen seien Injektionen, Suppositorien, Pessarien und Pulver genannt. Die Injektionen können durch Lösen von etwa 10 - 500 γ eines Polypeptides der Formel (i) in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung hergestellt werden. Die Polypeptide der Formel (i) können auch durch Zugabe von Mannitol als Excipienten in lyophilisierte Ampullenprodukte übergeführt werden und sind in dieser Form jederzeit als Injektionen gebrauchsfertig.
Die als Ausgangsmaterialien im erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Peptide können u.a. nach für die Peptidherstellung bekannten Verfahren hergestellt werden.
Die Erfindung wird anhand der nachstehend angeführten Beispiele näher erläutert.
In den Beispielen bedeuten folgende Abkürzungen den Rf-Wert bei DünnSchichtchromatographie an Silikagel mit den folgenden Lösungsmittelsystemen:
Rf : Chloroform/Methanol/Essigsäure 9:1:0,5 Rf : Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 30:10:3:5 Rf : n-Butanol/Äthylacetat/Essigsäure/Wasser 1:1:1:1
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•η.
Beispiel 1 ·
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-(D)-Nva-Leu-Arg-Pro-GIy-NH2
a) Herstellung von Z-(D)-Nva-Leu-Arg(N02)-Pro-(
Einer Lösung von Z-(D)-Nva-OH(380 mg), H-Leu-Arg(NO2)-PrO-GIy-NH2 (690 rag) und HONB (300 mg) in 5 ml Dimethylformamid werden 340 mg DCC bei 0 C unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden lang bei O0C und weitere 10 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird abfiltiert, um den entstandenen Dicyclohexylharnstoff zu entfernen 1 das FiItrat wird zur Trockne eingeengt· Der erhaltene Rückstand wird in 100 ml Chloroform gelöst und die Lösung mit einer 4 °£-igen wässerigen Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewä sehen. Die gewaschene Lösung wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit einem Gemisch aus Äthylacetat (25 ml) und Äther (25 ml) digeriert, man erhält ein weißes Pulver, das abfiltriert und aus Äthanol-Äther nochmals ausgefällt wird· Die Ausbeute beträgt 1,12 g, ^aJ^3-50,5°(c=l,l in Methanol), Rf1S=O, 32.
Analyse für
berechnet C, 53,32; H, 7,27j N, 19,43 gefunden C, 53,49s H, 7,56? N, 19,19
b) Herstellung von (Pyr)Glu~His-Trp~Ser-Phe-(D)-Nva-Leu-Arg-PrO-GIy-NH2 . ■
Z-(D)-Nva-Leu-Arg(NO2)-PrO-GIy-NH2 (1,0 g) wird in 10 ml 25 tigern Bromwasserstoff in Essigsäure gelöst und die Lösung 50 Minuten lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 200 ml trockenem Äther verdünnt, um einen Niederschlag zu erhalten, dieser wird abfiltriert und gut mit trockenem Äther gewaschen· Das gesammelte Pulver wird über Natriumhydroxid bei vermin-
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dertera Druck getrocknet. Dieses Pulver wird in 10 ml Dimethylformamid zusammen mit (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-0H(l,0 g) und HONB (440 mg) gelöst. Die Lösung wird auf O0C gekühlt und unter Rühren mit 400 mg DCC versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden lang bei O0C und weitere 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert, um den entstandenen Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, das Filtrat wird unter Zugabe von 100 ml Äther digeriert, um einen Niederschlag zu erhalten, welcher abfiltriert wird. Der gesammelte Niederschlag wird in 10 $£-igem wässerigem Äthanol gelöst und die Lösung über eine mit Polystyrolharz /~Amberlite XAD-2, 150 - 250 Mesh, 3,5 χ 25 cm, Rohm δ» Hass Co, Ltd. USAJ7 gefüllte Kolonne geleitet. Die Kolonne wird nach dem GradienteneIutionsverfahren mit 10 ^igem wässerigem Äthanol und 100 tigern Äthanol (500 : 550 ml) eluiert. Die Hauptfraktion (380 520 ml) wird gesammelt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 5 ml heißem Methanol gelöst und durch Zugabe von Äthylacetat nochmals ausgefällt, um das geschützte Decapeptidamid zu erhalten. 1,41 g, /""J^n4"35'4"0 (c=0»12» in Methanol), Rf2=0,20, Rf3=0,56.
Das geschützte Decapeptidamid (500 mg) wird in 5 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff zusammen mit 0,5 ml Anisol bei -700C gelöst. Nach 30 Minuten langem Rühren bei -5°C wird der Fluorwasserstoff abgedampft. Der entstandene Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung zweimal ma.t 10 ml Äthylacetat extrahiert· Die wässerige Schicht wird über eine mit Carboxymethylcellulose (2 χ 33 cm) gefüllte Kolonne geleitet, die Kolonne wird nach dem Gradientenelutionsverfahren unter Einsatz eines Ammoniumacetatpuffers als Eluens eluiert» /"0,005M, pH 6,8(500 ml) —- 0,2M, pH 6,8(500 ml)_7. Die Hauptfraktion wird gesammelt (420 - 680 ml) und lyophilisiert, wobei ein weißes Pulver erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 380 mg, Z~ol7q2-32,4°(c=0,52, in 5 #-iger Essigsäure, Rf2= 0,05, Rf3=0f68. . . .
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Aminosäureanalyse: His 1,01; Arg 0,98; Trp 0,87; Ser 0,94; GIu 1,00; Pro 1,02; GIy 1,00; Nva 1,01; Leu 1,00; Phe 0,97 (Peptidgehalt 84 %),
Beispiel 2
Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(D)-Nle-Leu-AXg-PrO-GIy-NH2 nach dem Festphaseverfahren
a) Herstellung von BOC-Gly-harz
In 60 ml Chloroform-Äthanol (2:l) werden 10 g Chlormethylharz eingebracht, (Cl-Gehalt 2,0nMol/g) darauf folgt die Zugabe von 10,5 g BOC-Gly und 8,4 ml Triethylamin. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt und dann 24 Stunden lang erhitzt. Das Harz wird abfiltriert und gut mit Dimethylformamid, dann mit Äthanol, Wasser, Äthanol und Äther in angegebener Reihenfolge gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 17,55 g. Die Aminosäureanalyse zeigt, daß dieses Harz 0,88 mMol/g BOC-Gly enthält.
b) Herstellung des (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr-(BzI)-D-Nle-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-harzes
In das Reaktionsgefäß einer automatischen Peptidherstellüngsvorrichtung (Modell APS-800 von Simadzu Seisakusho K.K., Japan) werden 2,177 g BOC-Gly-Harz, das wie oben angeführt hergestellt wurde, eingebracht und mit Dichlormethan 12 Stunden lang angequollen. Dann werden folgende Aminosäuren nach dem unten \ angeführten Schema eingebracht:
BOC-Pro, BOC-Arg(Tos), BOC-Leu, BOC-D-NIe, BOC-Tyr(Bzl), BOC-Ser(Bzl), BOC-Trp, BOC-His(Tos), (Pyr)Glu.
Dichlormethan (3 Minuten χ 3), —> 50 % Trifluoressigsäure/bichlormethan (10 bzw. 30 Minuten), —> Dichlormethan (3 Minuten χ 3), -$ Äthanol (3 Minuten χ 3), —VDichlormethan (3 Minuten χ 3) -> 10 % Triäthyla min/Chloroform (10 Minuten) -4
- 15 5 09837/0963
Chloroform (3 Minuten χ 3) —> Dichlormethan (3 Minuten χ 2) —■} BOC-Aminosäureanhydrid (hergestellt aus BOC-Aminosäure und ■ DCC nach einem bekannten Verfahren) (30 und 60 Minuten) —> Acetylierung (mit Säureanhydrid in Dichlormethan und Triethylamin) (1 Stunde) —> Dichlormethan (3 Minuten χ 3) /"nur (Pyr) GIu wird direkt mit DCC in Dimethylformamid kondensiert^.
. Das Harz wird mit Äthanol, Chloroform und Dimethylformamid, dann mit Äther gewaschen und getrocknet, die Ausbeute beträgt 6,20 g.
c) Herstellung von (Pyr)Glu-His(Tos)-Trp-Ser(BzI)-Tyr(Bzl)-D-Leu-Leu-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH2
In 50 ml mit Ammoniak gesättigtem Methanol werden 2,622 g des nach b) hergestellten Harzes suspendiert, die Suspension wird bei Raumtemperatur 70 Stunden lang gerührt.
Das Harz wird abfiltriert und mit Dimethylformamid gewaschen. Das Filtrat und die Waschwässer werden zusammengegeben, bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und mit Äther behandelt. Nach diesem Verfahren erhält man 1,187 g rohes Pulver.
588 mg dieses Produktes werden in einer trockenen Säule an 50 g Silikagel gereinigt, als Entwicklerflüssigkeit wird ein Lösungsmittelsystem aus Methanol und Chloroform verwendet· Man erhält 186 mg des gewünschten Produktes·
d) Herstellung von (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-GlyNH2
In Gegenwart von 0,2 ml Anisol und 0,2 ml Mercaptoäthanol werden 173,3 mg des nach c) hergestellten, geschützten Peptides in 5 ml trockenem Fluorwasserstoff gelöst, die Lösung wird bei
- 16 -
509 8 37/096 3
OWC 1 Stunde lang gerührt. Nach Ablauf dieses Zeitraumes wird sie bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und das Konzentrat in 20 ml Wasser gelöst» Die unlöslichen Stoffe v/erden abfiltriert und das Filtrat über eine Kolonne (1,5 cm Durchmesser χ 20 cm) eines stark basischen Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA- 41oAcetat-Form, Rohm & Haas Co.Ltd· USA) geleitet. Die vorgereinigten Effluenten werden anschließend mittels Carboxylriiethylcellulose (1,5 x 22 cm; nach dem Gradientenelutionsverfahren unter Einsatz von 0,005 M bis 0,2 M Ammoniumacetat mit einem pH-Wert von 6,8) und hierauf über Polystyrolharz (Amberlite XAD-2, Rohm & Haas Co.Ltd.USA) (1,5 χ 7,5 cm, nach dem Gradientenelutionsverfahren unter Verwendung von 5-70 2o-igem wässerigem Äthanol) gereinigt. Das Eluat wird der GeIfiltrationschromatographxe an Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) (0,9 χ 53,5 cm, 0,1 N Essigsäure) unterworfen. Man erhält 39 mg der gewünschten Verbindung. ^£"~ct_7D -40,5°(c=0,5 in 5$-iger wässeriger Essigsaure)
Aminosäureanalyse (Säurehydrolyse in Gegenwart von Thioglycolsäure): GIu 0,97; His 0,97f Trp 0,94; Ser 0,88; Tyr 1,0; Leu 1,00; Nie 1,06; Arg 1,03; Pro 1,00; GIy 1,03 (87 % Ausbeute)
Beispiele 3-13
In der "nachstehenden Tabelle sind Decapeptidamide der Formel (i) angeführt, v/elche nach einem in Beispiel 2 angeführten ähnlichen Verfahren, jedoch unter Einsatz der in der Tabelle angegebenen Ausgangsmaterialien anstelle der in Beispiel 2 angeführten hergestellt wurden.
- 17 -
5098 37/0 96 3
. Tabelle ·
Beispiel Decapeptidamide
(I)		 D-S er R3 „ in 5 ?o-iger
wässeriger
_Essig saure _		 ti
Aminosäureanalyse		 Au sgang sfnateria lien die anstelle
der in Beispiel 2 angeführten
einqesetzt wurden		 BOC-D-NIe BOC-Leu
3 D-ATm Leu . -44.8° His 1.02; Arg 1.01;
Trp 0.97; Ser.1.91; '
GIu 1.00; Pro 1.01;
GIy 1.03; Leu 0.97;
Tyr 0.96		 BOC-Tyr(BzI) BOC-D-Ser
(BzI)		 BOC-Leu
509837/0963
- 18 - · 		4 Tyr D-Nva Leu -43.2° His" 0.-96; Arg 1.00;-
Trp 0.89; Ser 0e92;
GIu 1.00; Pro 1.00;
GIy 0.99; Abu 0.97;
Leu 1.005 Tyr O.§8		 BOC-Tyr(BzI) BOC-D-Abu BOC-Leu
5 Tyr D-!Ehr Leu -38.9° His 1.00; Arg 0.99;
Trp 0.92; Ser 0.91;
GIu l.OO.j Pro 1.00; ■'
GIy. 1.01; NVa 0.97; ■
Leu 0.98; Tyr 0.98 , '		 BOC-Tyr(BzI) BOC-D-Nva BOC-Leu .
6 Tyr Leu . -37.5° His 1.01;' Arg 0.98;
Trp 0.95; Thr 1,00;
Ser 0.92; GIu 1.00; '
Pro 1.00; GIy 0,99?
Leu 1.00; Tyr 0.98		 BOC-Tyr(BzI) BOC-D-Thr
4		 BOC-Leu
Ty'r •BOC-Tyr(BzI)
OO Ca)
• • R2 R3 Tabelle Aminosaureanalyre Ausgangsmaterialien die anstelle
der in Beispiel 2 angeführten
einqesetzt wurden		 BOC-D-NIe BOC-Leu •
C
•
D-Phe Leu ■ His 1.00; Arg 0,99;
Trtt 0.87; Ser 0.89;
Glü 1.00; Pro 0.99;
GIy 1.01; Leu 0.98;
Phe 1.00; Tyr 0.96		 BOC-Tyr(BzI) BOC-D-Phe BOC-Leu
Beispiel Decapeptidamide
(I)		 D-Met Leu in 5 %~iger
wässeriger
Essigsäure		 His 0.98; Arg 1.00; .
Trp 0.89; Ser 0..92;
GIu 0.99; Pro 0.98; ' ·
GIy 1.00; Met 0.79; '
Leu 1.00; Tyr 1.00		 'BOC-Tyr(BzI) BOC-D-Met BOC-Leί 2509783
7· Rl D-Phe Leu '· -52.4° His 1.00; Arg 0.98;.
Trp 0.87;. Ser 0.98;
GIu 1.01; Pro 0.98; .
GIy 1.,OO; Leu 1,00;
Phe 1.98		 BOG-Tyr(BzI) BOC-D-Phe BOC-Leu
8 · Tyr D-Abu lie -42.0° His 1.00; Arg 1,00;·
Trp 0.92; Ser 0.88; '·
GIu 1.03;'Pro 1,00; ·
GIy 1.00; Abu 0.96;
lie 0.98; Tyr/0.98 ;		 BOC-Phe BOCrD-Abu
■*.		 BOC-IIe
9 Tyr • -69.5° : ■.... ,.BOC-Tyr (BzI)
10 Phe ' -38.5° . , ·
Tyr
Tabelle
^*1
3 Η· eniO Ό ·
H, O*
Φ ·
co
CD
I ω
O CO
co
33
Γ"·
Beispiel Decapeptidamide
• (I)		 D-Ser R3 in 5 %-iger
wässeriger
Essigsäure		 . AminosHu'reanalyse Ausgangsmaterialien die anstelle
der in Beispiel 2 angeführten
einqesetzt wurden		 BOC-D-NIe BOC-Leu
11 R1 J R2 D-NIe NIe • -52.5° ' His 0.96; Arg 0.94;'
Trp 0.87; -Ser 1.87;
GIu 1.00; Pro 0.99;
GIy 1.00; Nie 0,96;
Phe 1.02		 BOC-Tyr(BzI) BOC-D-Ser
(BzI) .		 BOC-NIe
12 Phe D-Nva NIe -55.1° His 1.00; Arg 1.01;. ·
Trp 0.81; Ser 0.89;
GIu 1.02; Pro 1.00;
GIy 1.00.; Nie 2.05;
Phe 0.97		 BOC-Phe . BOC-D-NIe BOC-NIe
15 Phe He -55.5° His 0.96; Arg 1.00;
Trp 0,86; Ser 0.89;
GIu 1.00; Pro 1.00;
GIy 0.98; Nva 0.90; .
He 0.92; Phe'0.99		 BOC-Phe BOC-D-Nva BOC-IIo
1
(
Phe BOC-Phe
ω ρ»
CD C0
CO.. CO

Claims (13)

  1. Patentansprüche:
    worin R1 Tyr oder Phe, R2 D-NIe, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr oder D-Met und R3 Leu, He oder Nie bedeuten-
  2. 2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 für Tyr, R2 für D-NIe und R3 für Leu stehen.
  3. 3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 Tyr, R2 D-Ser und R3 Leu bedeuten. l.
  4. 4. Verbindung nach Anspruch X, dadurch gekennzeichnet, daß R1 Tyr, R2 D-Abu und R3 Leu bedeuten.
  5. 5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, •daß R1 Tyr, R2 D-Nva und R3 Leu bedeuten.
  6. 6. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 Tyr, R2 D-Thr und R3 Leu bedeuten.
  7. 7. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 Tyr, R2 D-Phe und R3 Leu bedeuten. - "
  8. 8. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 Tyr, R2 D-Met und R3 Leu bedeuten.
  9. 9. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 Phe, R2 D-Phe und R3 Leu bedeuten.
  10. 10. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet* daß R1 Tyr, R2 D-Abu und R3 He bedeuten.
    - 21 - .
    509837/0 96 3
  11. 11· Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 Phe, R2 D-Ser und R3 Nie bedeuten.
  12. 12· Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 Phe, R0 D-NIe und RQ Nie bedeuten.
  13. 13. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Rj1 Phe, R2 D-Nva und R3 He bedeuten.
    14· Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    daß R. Phe, R0 D-Nva und R- Leu bedeuten.
    15· Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-R1-R2-R3-Arg-Pro-Gly-NH2
    worin R1 Tyr oder Phe, R2 D-NIe, D-Nva, D-Abu, D-Phe, D-Ser, D-Thr oder D-Met und R3 Leu, He oder Nie bedeuten, dadurch
    gekennzeichnet, daß ein Reaktant (A) L-Pyroglutamin-
    säure oder ein Peptidfragment mit einer N-endständigen L~Pyroglutaminsäureeinheit (wie z.B. (Pyr)Glu-), welches von dort an die oben angeführte Amiriosäuresequenz aufweist,
    mit einem.Reaktanten (B) einer Aminkomponente, die dem
    Rest des oben angeführten Decapeptidamidderivates entspricht, —- kondensiert wird, wobei die Reaktanten (A) und (Β) gegebenenfalls geschützt sind und die Schutzgruppen gegebenenfalls entfernt werden.
    509837/0963
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